PPGNCG PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIA E COGNIÇÃO FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC Telefone/Ramal: Não informado http://propg.ufabc.edu.br/neuro

Banca de DEFESA: MARILIA INES MOVIO

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : MARILIA INES MOVIO
DATA : 07/04/2020
HORA: 14:00
LOCAL: sala S17, Térreo, Bloco Delta, Campus SBC da Fundação Universidade Federal do ABC, localizada na Alameda da Universidade, s/n, Bairro Anchieta - São Bernardo do Campo, SP.
TÍTULO:

Expressão funcional do papel de AGO2 no desenvolvimento da retina


PÁGINAS: 88
RESUMO:

A retina é um tecido neural com células altamente especializadas para o processamento e transmissão luminosa. Durante o processo de desenvolvimento desse tecido, as células progenitoras retinianas (do inglês retinal progenitor cells (RPCs)) são guiadas por fatores intrínsecos e extrínsecos para se tornarem células específicas com picos de desenvolvimento bem definidos e filogeneticamente conservado entre espécies. Dentre esses fatores, destaca-se os microRNAs (miRNAs). Os miRNAs são pequenos RNAs não codificantes que controlam a produção proteica de forma pós-transcricional. A ação desses miRNAs depende de uma maquinaria bem orquestrada, onde é particularmente importante a presença da proteína Argonauta-2 (AGO2). Além de estar relacionada com a biogênese de miRNAs, AGO2 também foi descrita em processos não-canônicos nucleares, principalmente no que concerne a atuação em processos epigenéticos. Entretanto, o conhecimento sobre o papel de AGO2 durante o desenvolvimento é limitado. Portanto, o principal objetivo desse trabalho é caracterizar o papel funcional da proteína AGO2 no desenvolvimento da retina. Para isso, ratos Long Evans recém-nascidos (P0) e adultos (P60) foram provenientes do biotério de manutenção da UFABC, mantidos em um ciclo claro-escuro (12:12h) com comida e água ad libitum. Os animais foram eutanasiados por injeção intraperitoneal de uretana (25%) e posteriormente decaptados. As retinas foram isoladas para a parte descritiva de AGO2 durante o desenvolvimento usando técnicas de i) PCR em tempo real (n=6), ii) western blot (WB, n=5) e iii) imunofluorescência (IF, n=6). Também foi aplicado análises de correlação por coeficientes de Manders e de Spearman (n=6) para a colocalização AGO2-núcleo. Para induzir o knockdown de AGO2, oligômeros Morpholino (MO) ou seu controle (Ctl) foram injetados no espaço subretiniano de animais P0, e as retinas foram isoladas após 2, 5 e 7 dias para as técnicas de WB (n=8), IF (n=6), marcação de hematoxilina e eosina (HE, n=6), e ensaio de TUNEL (n=5) a fim de avaliar as consequências do knockdown de AGO2 em: i) Proliferação e apoptose retiniana, ii) Maturação, e iii) Citogênese após o nascimento. Para o knockout de AGO2, foi montado um sistema de CRISPR/Cas9 knock-in de co-transfecção que consiste na substituição da sequência de AGO2 por uma sequência codificadora de proteína fluorescente azul (eBFP). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Uso de Animais da UFABC (16/2014 e 1102011018) e os resultados foram analisados por estatística descritiva e comparados por teste-t pareado. PCR e WB demonstraram que tanto a expressão gênica e proteica de AGO2 é menor em P0 (PCR: 2^-1=0.5-dobro da expressão; P<0.05; WB: P0: 0.57±0.07 vs P60: 1.18±0.09 densidade óptica normalizada, P<0.01). IF e fracionamento proteico não demonstraram diferença de AGO2 no citosol, enquanto em P60 há um acúmulo de AGO2 no núcleo (P0: 15.63±1.77 vs P60: 23.95±2.32, P<0.05). Quando foi analisado as células AGO2+, os resultados demonstraram que a localização de AGO2 depende do estado de diferenciação celular. Em P0, análise de Spearman demonstrou uma baixa colocalização AGO2-núcleo em células imaturas comparando com as maduras (-0.04±0.22 vs 0.25±0.18, P<0.05), enquanto Manders não demonstrou diferenças na AGO2 nuclear entre as idades. Nas células imaturas, AGO2 demonstrou estar mais relacionado à fase de mitose do que a fase de síntese. O tratamento com o oligômero MO causou uma diminuição da expressão da proteína AGO2 em cerca de 52% 7 dias após a intervenção, e o knockdown parece afetar mais a porção nuclear do que a citoplasmática (Ctl: 0.45±0.08 vs. MO: 0.35±0.0324, P<0.05). A falta de AGO2 parece induzir diversas alterações na retina, como redução na espessura da camada nuclear interna (Ctl:17.37±1.25 vs MO:13.69±1.38, P<0.05), diminuição dos filamentos DCX (Ctl: 0.29±0.04 vs. MO: 0.19±0.01, P=0.0342), e parece impactar diferentemente os subtipos retinianos específicos: as células bipolares PKCα+ e as gliais GFAP+ demonstraram uma alteração reversível, enquanto as células amácrinas CR+ e ChAT+ demonstraram alterações irreversíveis (CR+: Ctl: 4.58 ± 1.56 vs MO: 11.17 ± 2.19, P<0.05 em P7, Ctl: 32.43±4.14 vs. MO: 47.25±5.73, P<0.05, paired t-test, em P18; ChAT+: Ctl: 5.50 ± 0.58 vs MO: 6.00 ± 0.71, P<0.05 em P7, Ctl: 59.00±3.79 vs. MO: 48.33±3.66, P<0.05, paired t-test, em P18). Os demais subtipos não demonstraram alteração. O knockout de AGO2 usando plasmídeos demonstraram transfecções in vivo promissoras, e as células knock-in parecem estar preferencialmente na camada nuclear externa. Considerando tudo, nossos resultados demonstraram que a proteína AGO2 se transloca para o núcleo durante o desenvolvimento retiniano, e sua presença é essencial para a formação coordenada das camadas retinianas e a diferenciação de seus subtipos específicos.


MEMBROS DA BANCA:
Presidente - Interno ao Programa - 1676367 - ALEXANDRE HIROAKI KIHARA
Membro Titular - Examinador(a) Interno ao Programa - 1872537 - MARCELA BERMUDEZ ECHEVERRY
Membro Titular - Examinador(a) Externo à Instituição - ANDRÉ MAURICIO PASSOS LIBER - USP
Membro Suplente - Examinador(a) Interno ao Programa - 1674604 - YOSSI ZANA
Membro Suplente - Examinador(a) Interno ao Programa - 1887027 - FERNANDO AUGUSTO DE OLIVEIRA RIBEIRO
Membro Suplente - Examinador(a) Externo à Instituição - GUILHERME SHIGUETO VILAR HIGA - UFABC
Notícia cadastrada em: 01/04/2020 13:31
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