Análise do efeito do inibidor de serinoprotease rBmTI-A em células pulmonares A549.
O enfisema pulmonar é caracterizado pela destruição do tecido alveolar , apresenta-se como uma das manifestações da DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica) que é uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no mundo. Algumas proteases estão envolvidas com o processo de instalação do enfisema como a elastase de neutrófilos humana (HNE).
O inibidor de serionoproteases rBmTI-A é originário do carrapato Rhipicephalus Boophilus microplus, pertence à família Kunitiz- BPTI e apresenta dois domínios inibitórios e atividade sobre elastase de neutrófilos humana (HNE), tripsina bovina, plasmina e Calicreína Plasmática Humana. Em trabalho anterior do grupo foi demonstrado uma atividade pelo rBmTI-A de prevenção ao desenvolvimento do enfisema pulmonar, induzido por elastase pancreática porcina (PPE), em camundongos. Aparentemente este efeito ocorre por meio do controle da resposta inflamatória por rBmTI-A.
No presente trabalho, analisamos a resposta inflamatória induzida por elastase pancreática porcina em células pulmonares humanas A549 e investigamos a ação do inibidor rBmTI-A nessas células. O inibidor rBmTI-A foi expresso, purificado e as análises bioquímicas foram realizadas comprovando que o inibidor estava ativo. As células A549 foram incubadas com diferentes concentrações de PPE por uma hora ou 16 horas, ambas as condições com controle sem a PPE. O sobrenadante e as células resultantes foram usados para análises de taxa de detachamento, viabilidade celular, analise proteolítica dos sobrenadantes de cultura e real time PCR para verificar a expressão de IL8 e IL6. Também foi realizado ensaios com rBmTI-A em diferentes concentrações e a PPE (0,0125U/ml). Nesses ensaios rBmTI-A foi pré-incubado com as células por duas horas seguido de adição da PPE e incubação por 16h, para esse teste foi realizado teste de viabilidade celular e ELISA para IL8.
Como resultados, os dois modelos de padronização da indução da inflamação nas células A549 houve diferença na expressão de IL8 e IL6. No ensaio utilizando o inibidor e a PPE a concentração de 28 nM foi a que apresentou resultados mais expressivos, a incubação com o inibidor mostrou diminuição de 71% dos níveis de IL8 comparado com os níveis quando administrado com PPE somente, ou seja, foi capaz de reverter o quadro instalado pela ação da PPE. Como conclusões desta etapa do trabalho verificamos que a PPE é capaz de induzir secreção de interleucinas (IL6 e IL8), e o inibidor rBmTI-A pode diminuir esse aumento, provavelmente interferindo na indução da resposta inflamatória em células A549 por PPE.