INVESTIGAÇÃO DA QUITINASE DE KINETOPLASTIDA PARA O DIAGNÓSTICO E FILOGENIA DE LEISHMANIA
A leishmaniose é uma doença infecciosa que afeta humanos, animais domésticos e silvestres, causada por 20 das 53 espécies de Leishmania conhecidas. O gênero Leishmania, pertencente à Família Trypanosomatidae e Ordem dos Kinetoplastida, estão agrupados em cinco subgrupos de acordo com a história evolutiva e biogeográfica dos parasitas e seus respectivos hospedeiros, que leva a incongruências e parafiletismos. A quitinase de GH18 de Leishmania, codifica por um gene de cópia única espécie-específico, conservada em táxons basais de tripanossomatídeos, e ausente no gênero Trypanosoma, foi avaliado como um marcador filogenético e alvo para diagnóstico. O trabalho foi dividido em duas partes. Para a primeira parte, primers foram desenhados para detectar Leishmania em amostras biológicas de hospedeiros para obter sequências do gene não disponíveis e bancos de dados públicos. O gene da quitinase GH18 e seu contexto genômico foi avaliado filogeneticamente. Um protocolo para diferenciar os subgêneros de Leishmania por PCR e RFLP foi desenvolvido utilizando ferramentas in silico. O método para detectar um fragmento de 953 pb da quitinase GH18 por PCR apresentou alta sensibilidade e especificidade em DNA de isolados de parasitas. A preservação do locus da quitinase demonstrou uma possível origem marinha do gene da quitinase GH18 e a reconstrução filogenética corrobora a Origem de Supercontinente da Leishmania. Para a segunda parte do trabalho, foi extraído o DNA de fígado de anuros coletados no Parque Natural Municipal Nascentes de Paranapiacaba (Paranapiacaba - SP). Foram feitas detecção de Trypanosomatidae nas amostras de anuros através de PCR que amplificam o gene que codifica a quitinase e os marcadores gGAPDH e 18SrRNA. Os resultados positivos foram sequenciados e demonstraram que todos os anuros estavam infectados por um mesmo parasita com maior homologia à Leishmania lainsoni. O resultado para o gene que codifica a quitinase foram mais sensíveis que os outros marcadores e corroboram a hipótese de origem marinha apresentada na primeira parte do trabalho.