EFEITO DO INIBIDOR DE SERINOPROTEASE RBMTI-A NO PROCESSO INFLAMATORIO EM CÉLULAS PULMONARES A549
O inibidor de serinoproteases rBmTI-A é uma proteína recombinante baseada em um inibidor originário do carrapato Rhipicephalus microplus, pertence à família Kunitz-BPTI, é constituído de dois domínios inibitórios e tem atividade sobre elastase de neutrófilos humana (HNE), tripsina bovina, plasmina e Calicreína Plasmática Humana. Em trabalho anterior de indução do enfisema pulmonar com elastase pancreática porcina (PPE) em camundongos, o inibidor mostrou prevenção da instalação do enfisema em comparação com o grupo não tratado com redução da resposta inflamatória. No presente trabalho, realizamos a expressão, purificação e verificação da atividade inibitória do rBmTI-A; analisamos a resposta inflamatória induzida por PPE em células pulmonares humanas A549 e investigamos a ação do rBmTI-A nesse processo; além disso, analisamos o envolvimento dos receptores ativados por protenase (PAR) no aumento de citocinas decorrente da ação da PPE. Para isso, as células foram incubadas com diferentes concentrações de rBmTI-A por duas horas seguido da adição de PPE (0,0125 U/mL) , foram feitos controles apenas incubando as célulascom meio, PPE ou inibidor,após 16 horas, os sobrenadantes foram destinados para quantificação de citocinas inflamatórias por ELISA ou ensaio Multiplex, enquanto, que as células foram submetidas à ensaio de viabilidade por MTT ou extração de RNA e posterior qPCR para análise de transcrição de citocinas inflamatórias. Procedimento semelhante foi realizado com o uso de peptídeos antagonistas PAR-1 e PAR-2 incubados por 30 minutos seguido da adição de PPE (0,0125 U/mL). Como resultados verificamos que a PPE na concentração de 0,0125 U/mL não alterou a viabilidade celular e promoveu aumento de expressão relativa de citocinas inflamatórias. rBmTI-A em uma concentração de 8 nM promoveu diminuição de citocinas expressas em comparação com o grupo induzido com PPE, com níveis de IL-8, IL-6, MCP-1 e TNF-α reduzidos em 56%, 20%, 45% e 64%, respectivamente. Com relação à secreção de citocinas no sobrenadante, rBmTI-A na concentração de 8 nM reduziu 50% da liberação de IL-8 e 75% da liberação de MCP-1. IL-10, por outro lado, não foi detectada por qPCR nem no ensaio Multiplex . Os antagonistas PAR-1 e PAR-2 a 50 µM foram suficientes para reduzir a expressão gênica e secreção de IL-8 nas células estimuladas com PPE, apresentando níveis próximos ao controle. Por meio dos resultados de análise das citocinas no modelo experimental em células A549, concluímos que o tratamento com rBmTI-A pode diminuir o processo inflamatório causado pela ação de PPE nessa linhagem celular, e, adicionalmente, sugerimos que o aumento dessas citocinas, principalmente de IL-8, está ligado a ação de PPE nos receptores PAR-1 e PAR-2.