Banca de DEFESA: ISAC JOSÉ DA SILVA FILHO

Uma banca de DEFESA de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : ISAC JOSÉ DA SILVA FILHO
DATA : 20/01/2025
HORA: 09:00
LOCAL: Remota: https://meet.google.com/tvo-ccmo-tiw
TÍTULO:

AVALIAÇÃO DE Chlamydomonas reinhardtii COMO PLATAFORMA DE PRODUÇÃO DO MEDICAMENTO BIOLÓGICO ADALIMUMABE

PÁGINAS: 110
RESUMO:

As microalgas são um grupo diversificado de microrganismos fotossintéticos, encontrados em diversos habitats ao redor do mundo, desempenhando um papel fundamental no meio ambiente. Elas são capazes de sintetizar proteínas, carboidratos, lipídios e outros compostos essenciais para sua homeostase e para o ecossistema. Devido a esses metabólitos, as microalgas despertaram interesse comercial a partir do século XX, com aplicações que cresceram ao longo do tempo, incluindo o uso de engenharia genética para a produção de proteínas recombinantes. Dentre as microalgas mais utilizadas, Chlamydomonas reinhardtii, uma microalga verde unicelular, se destaca como modelo devido ao seu extenso histórico de pesquisa. A produção de proteínas recombinantes em microalgas oferece uma alternativa sustentável e econômica para a obtenção de proteínas terapêuticas de interesse humano. O objetivo deste trabalho foi expressar o anticorpo monoclonal Adalimumabe (mAb), uma proteína terapêutica utilizada no tratamento de doenças autoimunes, nos genomas do cloroplasto e do núcleo da C. reinhardtii. Foram usadas ferramentas de engenharia genética nas cepas CC-125, CC-400, CC-503 da C. reinhardtii. Vetores foram construídos para os genomas do cloroplasto (IJ1) e do núcleo (IJ2 e IJ3), e técnicas de transformação genética como eletroporação e pérolas de vidro foram utilizadas para inserir o gene de interesse na C. reinhardtii. A confirmação do gene de interesse foi feita por PCR convencional e/ou análise em leitor de microplacas. Ensaios de SDS-Page, Western Blotting (WB) e purificação com resina anti-FLAG foram empregados. Colônias transformadas estáveis foram obtidas em meio seletivo com antibiótico para as três construções de vetores, utilizando a técnica de transformação por pérolas de vidro. Contudo, a proteína recombinante foi detectada apenas para as colônias transformadas no genoma do cloroplasto (IJ1) usando a cepa CC-503. A detecção dessa proteína ocorreu acima do peso molecular esperado, possivelmente devido à agregação proteica, resultante da ausência de glicosilação nas proteínas produzidas no cloroplasto. Colônias transformadas com os plasmídeos IJ2 e IJ3 usando a cepa CC-400 também foram analisadas. A proteína repórter fluorescente foi observada nas colônias transformadas com IJ2, mas a proteína alvo não foi detectada no SDS-Page e WB. Apenas uma colônia transformada com IJ3 apresentou o gene positivo para a proteína alvo, mas a proteína não foi identificada nas análises, sugerindo um possível falso positivo ou silenciamento do gene. Conclui-se que, na transformação nuclear C. reinhardtii, apesar da detecção da proteína repórter mCherry com o plasmídeo IJ2, a expressão da proteína Adalimumabe foi comprometida por rearranjos genômicos e silenciamento pós-transcrição. Além disso, a ocorrência de possíveis falsos positivos nos ensaios de PCR, como observado com o plasmídeo IJ3, destaca as limitações dos métodos utilizados e a necessidade de vetores e promotores mais otimizados. Na transformação do cloroplasto, embora o gene tenha sido incorporado com sucesso, a ausência de glicosilação levou à agregação proteica. Estratégias alternativas, como a expressão separada das cadeias leve e pesada do anticorpo, podem ser eficazes para contornar esses problemas. Apesar das limitações, o estudo confirma o potencial de Chlamydomonas reinhardtii como uma biofábrica promissora para a produção de proteínas terapêuticas.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - Interno ao Programa - 3053215 - LIVIA SENO FERREIRA CAMARGO
Membro Titular - Examinador(a) Interno ao Programa - 3065803 - WAGNER RODRIGO DE SOUZA
Membro Titular - Examinador(a) Interno ao Programa - 3292123 - DANILO TRABUCO DO AMARAL
Membro Titular - Examinador(a) Externo ao Programa - 2605490 - SERGIO DAISHI SASAKI
Membro Titular - Examinador(a) Externo à Instituição - LARISSA PEREIRA BRUMANO
Membro Suplente - Examinador(a) Interno ao Programa - 1601025 - MARCELLA PECORA MILAZZOTTO
Membro Suplente - Examinador(a) Externo à Instituição - ELEANE DE ALMEIDA CEZARE GOMES
Membro Suplente - Examinador(a) Externo à Instituição - KAROLINE ESTEFANI DUARTE